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细胞染色的流程指南，请查收~

作者： 来源：本站 浏览次数：次

流式胞内蛋白染色，很关键的一点是需要知道要染的蛋白在哪个位置，这样才能选对操作流程和buffer体系。


01.


细胞表面染色


（一） 细胞样品准备

1. 样本准备

（1）取出目的组织（如:脾脏、 淋巴结、 胸腺、 骨髓等）， 迅速浸泡在 Cell Staining Buffer 中， 并应用研磨及过滤等方法制备成单细胞悬液；如果为体外培养细胞， 直接用 Cell Staining Buffer 重悬细胞后进行下一步操作。
（2）添加 Cell Staining Buffer 至约 15mL， 离心（350 x g） 5 分钟后弃去上清液。
货号
 		名称
 		品牌
9803

Cell Lysis Buffer (10X)

CST


2. 裂解红细胞（脾脏组织等）

（1）如样品为脾脏组织细胞， 需要裂解红细胞。把 10X 红细胞裂解液(RBC Lysis Buffer ) 用去离子水稀释成 1X 工作液。然后用 3 ml 红细胞裂解工作液重悬细胞后， 在冰上孵育 5 分钟。
（2）加入 10 ml Cell Staining Buffer 到管中；离心（350 x g） 5 分钟后弃去上清液。
（3）重复洗涤细胞一次（步骤 2） 。
（4）用 Cell Staining Buffer 重悬细胞后计数， 稀释细胞为 5-10 x 106 细胞/ml， 然后每支流式检测管中加入100uL 细胞悬液（5-10 x 105 细胞/管） 。

货号
 		名称
 		品牌
AR1118

红细胞裂解液

Boster/博士德

46232

RBC Lysis Buffer (10X)

CST


3. 设置实验分组

实验分组

作用

阴性/空白对照

调节仪器电压

单染/单阳对照

调节补偿

同型对照

消除背景染色

FMO对照

确定设门的准确性

生物学对照

实验结果对比

实验组

实验结果


4. 封闭Fc受体

封闭Fc受体能减少染色过程中的非特异性染色。

小鼠中，纯化的CD16/CD32单抗能和FcγRⅢ/Ⅱ结合，封闭非特异性染色，使阴性细胞的背景荧光降至未标记细胞的水平。加入0.5-1μg纯的抗小鼠CD16/32单克隆抗体，室温孵育10分钟。

对于人和大鼠，可直接使用过量的与荧光抗体相同来源和亚型的纯化Ig或者相同来源血清进行阻断，或者用商业化的Fc受体阻断剂。


（二） 细胞染色步骤

1） 按照说明书的推荐用量加入荧光标记抗体，混匀后置于4℃，避光孵育30分钟。

2） 加入细胞染色buffer (或含1%BSA的PBS)重悬细胞，300g离心细胞悬液5分钟，弃掉上清。

3） 加入200μL细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)重悬细胞，用流式细胞仪进行检测和分析。


02.


 细胞内细胞因子染色步骤


（一） 细胞样品准备

1. 收集细胞，200目筛网过滤，收集滤液，300 g离心5 min，弃上清。
2. 向细胞中加入适量细胞染色buffer(或含1%BSA的PBS)，用移液枪轻轻吹打细胞重悬。
注：
（1）不同的细胞因子和趋化因子有不同的表达谱， 为了获得最佳的染色信号， 不同指标的刺激条件应该分别优化。
（2）一些抗体识别天然的细胞表面抗原， 而不能识别被固定的或者变性的抗原。因此对于这类抗原， 建议在固定破膜和胞内染色之前， 对活细胞进行表面染色。如果固定后再染细胞表面标记， 要慎重选择抗体的克隆号。而当实验者凭经验发现一些专门识别经多聚甲醛变性的抗原的克隆时， 便可改变实验步骤， 即固定细胞之后再进行表面抗原染色。

（二）固定与穿透
进行胞内染色之前应固定细胞，确保可溶性抗原以及半衰期较短的抗原的稳定性。这样可让目标蛋白质在细胞中保持在原本的位置。
如需检测胞内抗原，应在染色之前进行细胞穿透处理。抗体应在具有穿透功能的缓冲液中制备，以确保细胞维持通透状态。在设门选定细胞群时，穿透处理后的细胞在流式细胞仪上的光散射特性将发生明显变化。NB 细胞表面染色应在固定之前进行。

（三）破膜

（1）按照说明书稀释固定破膜液。

（2）每管加入1mL细胞染色buffer，300g离心5min，弃上清。

（3）加入100μL细胞染色buffer，重悬细胞。

（4）每管加入1mL的1× Fixation Working Solution，轻柔混匀，4℃避光孵育30min。

（5）600g离心5min，弃上清。

（6）每管加入2mL的1×Permeabilization Working Solution，轻柔混匀。

（7） 600g离心5min，弃上清。

（8）重复（6）、（7）步一次。


（四）胞内抗体孵育

（1） 加入100μl 的1×Permeabilization Working Solution，重悬细胞。

（2） 对应的单染管、全染管加入相应的抗体5μL，混匀。
（3）室温避光孵育30分钟。
（4）加入1×Permeabilization Working Solution，重悬细胞。
（5）600g离心5分钟，弃上清。

（四）胞内染色

（1）根据上述说明固定组织样本

（2）加入 100 µL 洗涤剂为基础的穿透剂，在室温下避光孵育 15 min

（3）用 2 mL PBS（含 0.1% triton 或其它穿透洗涤剂）洗涤细胞，以 300 g (2,000 rpm) 的速度离心 5 min，弃去上清液，重悬剩余物中的沉淀

（4）按照直接和间接实验方案中的抗体染色步骤进行操作在穿透缓冲液中制备抗体，以确保细胞维持通透状态。


（五）上机检测



注意
（1）流式抗体要避光储存于2-8°C，严格避免反复冻融。
（2）使用抗体前，快速旋转使抗体恢复到最大体积，不建议斡旋混匀抗体。
（3）除操作说明外，所有的染色步骤一律在冰上或4℃避光操作。
（4） 缓冲液中加BSA或FBS可以减少固定破膜后的非特异性背景。
（5）固定和透化作用将影响eFluor纳米晶体的亮度，建议使用最短的固定和透化作用时间，染色后立即上机检测分析。
图片

 

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