1、原理

免疫组织化学（IHC）是利用抗原和抗体特异性结合的原理，使用抗体去标记组织细胞内的蛋白质，然后通过化学反应使抗体显色来确定组织细胞内的蛋白质的位置和表达量。

IHC-P：利用石蜡包埋组织切片进行的IHC。

IHC-F：利用冷冻切片进行的IHC。

        2、实验要点

1、样本制备

 最常见的方法是石蜡包埋。也可以选择冰冻切片——每种方法都有各自的优势和局限性。

	石蜡切片	冰冻切片
固定	先固定后切片	切片前或切片后固定
切片	常温切片机	冷冻切片机
储存	室温下多年	-80℃一年
组织脱水	必需	不必需
切片水化	必需	不必需
抗原修复	必需	不必需
优点	组织形态保存较好	酶活性和抗原功能保存较好
缺点	过度固定可能会遮蔽抗原	冰晶形成可能会破坏组织结构

1.在包埋之前必须先固定组织。可以在组织剥离之后立即用灌流或漫润的方法固定，通常需要4-24小时。不建议固定超过24小时，因为过度固定会导致抗原被遮蔽起来。如果不能立即包埋，可以将固定后的组织置于乙醇中暂时保存。

2.冰冻组织样品的好处之一是可以省去石蜡包埋之前的固定步骤，节约了时间。在冰冻和切片之后可以对样品进行短暂的固定。最常用的固定剂是乙醇，使用乙醇固定可以避免表位被甲醛交联，无需进行抗原修复。在冷冻恒温箱内将冰冻组织切片，切片可以在-80℃保存最多一年。

2、IHC 的实验流程（以下内容仅适用于石蜡包埋样品）

○载玻片制备：

●固定：醛类等固定蛋白和组织结构。 

●脱水：梯度乙醇脱去组织内的水份

●透明：二甲苯对组织进行透明

●浸蜡：液态石蜡浸润组织

●包埋：包埋石蜡块

●切片：蜡块切片并贴服在载玻片上

○脱蜡/复水脱蜡：二甲苯脱去切片中的石蜡

复水：梯度乙醇恢复组织水环境

注意：操作中任何时候都不要晾干玻片

1. 脱蜡处理/切片的水化：

a. 二甲苯浸洗切片 3 次，每次5min。b. 无水乙醇浸洗切片 2 次，每次10min。c. 95% 乙醇浸洗切片 2 次，每次10min。

2. 在蒸馏水中漂洗 2 次，每次 5 分钟。

○抗原修复

因为固定时形成的交联可通过阻止抗体与抗原接触来防止抗体结合；因此，需通过抗原修复（也称为抗原暴露或抗原表位修复）的过程来逆转交联。抗原修复可通过热诱导的方法（heat–induced epitope retrieval, HIER）或者酶解达到。

●加热修复  ：加热煮沸、微波炉、高压锅。（大多数情况下采用热修复，高压锅~微波炉＞水浴锅）

●酶解修复  ：胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K。

●修复液的选择  ：柠檬酸盐、EDTA、TE。（CST推荐产品：14746、14747）

1.缓冲液：CST 常推荐的两种缓冲液：pH6, 10mM 柠檬酸盐缓冲液和 pH 8, 1mM EDTA 缓冲液。（缓冲液是否适用于您的实验取决于您所使用的一抗。）一般而言，EDTA 缓冲液适用于多数磷酸化酪氨酸特异性抗体，而柠檬酸盐缓冲液适用于其他多数抗体。每天都需制备新鲜的1X溶液。

2.煮沸装置：载玻片在所推荐的缓冲液中加热煮沸一段时间后，才可引起抗原修复。该步骤通常在微波炉或高压锅中进行。

3.酶促抗原修复：胃蛋白酶、胰蛋白酶或者蛋白酶 K进行的酶解作用也可达到抗原修复。一些抗体需要通过酶而非 HIER 进行修复。

3、封闭与抗体孵育

用血清或蛋白封闭，防止非特异性抗体结合，并减少背景和潜在的假阳性结果。

○灭活内源性过氧化物酶 ：3% H2O2，室温孵育切片10 min，PBS洗3次，每次5 min。

○封闭：在含有 Tween® 20 的TBST 缓冲液和 5% 正常山羊血清 (NGS) 中封闭样品，时长1h。(建议使用与二抗来源相同的血清进行封闭。)（cst封闭液推荐：9997、5427、15019）

○一抗孵育：去除封闭剂，组化笔画框将组织片框起来，每个组织上滴加50ul抗体，湿盒中4 ℃ 过夜。（cst一抗推荐：4060、抗体稀释液：8112）

○清洗：洗去一抗， TBST 清洗石蜡切片(IHC–P)或者 TBS 清洗冰冻切片(IHC–F)，清洗三遍，每次为5min。

○二抗孵育：加二抗，每个组织上滴加50ul抗体，湿盒中37 ℃ 30min。

○清洗：吸去二抗，PBS洗3次，每次5min。

当一抗来源物种与被检测样品物种相同时，二抗则可能会与某些组织中的内源性免疫球蛋白结合，导致背景过高（例如鼠对鼠染色)。可以使用一个未经一抗染色的对照载玻片，以确定二抗是否是背景染色的来源。

4、显色与封片

○显色：新鲜配制DAB显色液，每个组织滴加50ul，显微镜下控制显色，PBS终止显色。（二氨基联苯胺 (DAB) 底物是基于过氧化物酶检测系统中最常用的色原之一。CST推荐货号：8059、8114、8125）

○苏木素复染：苏木素染液室温染色后自来水冲洗20-30min，显微镜下随时观察显色情况。（CST推荐货号：14166）

○脱水：95%乙醇2次，每次10s，100%乙醇2次，每次10s，二甲苯2次，每次10s。

○封片：使用中性树胶进行封片。（CST推荐货号：14177）

1.当一抗来源物种与被检测样品物种相同时，二抗则可能会与某些组织中的内源性免疫球蛋白结合，导致背景过高（例如鼠对鼠染色)。可以使用一个未经一抗染色的对照载玻片，以确定二抗是否是背景染色的来源。

2.如使用DAB以外的色原，请确保检查其与封固剂是否相溶。有些色原可溶于有机溶剂，且需要使用水性封固剂。使用水性封固剂时，应跳过脱水步骤。

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