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检测方法
比色
荧光
化学发光
例如,偶联 AP 或 HRP 的检测抗体还可用于化学发光检测。在这类实验中,如有过氧化物,AP 或 HRP 会氧化鲁米诺,从而在 425 nm 处发光。这种检测类型的优势是动态范围通常更宽,背景信号更弱,因此灵敏度提高。信号不如其他 2 种检测类型稳定,并且必须在产生信号后的短时间内读取。
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ELISA 组分
现已开发了多种试剂盒来简化 ELISA 实验,并加速、简化和标准化每种 ELISA 的流程。现已开发试剂来提升特异性、可重复性和灵敏性,并最大程度降低成本。但没有预制试剂盒来评估某种特殊目的靶标时,实验者可以制备平板和必要的试剂。以下是有关一个 ELISA 实验所需的组分的概述。
样品制备
缓冲液
包被缓冲液 - 这种缓冲液可用来稳定某种抗原或抗体,从而促进抗原或抗体被吸收到孔的表面。
抗原或包被抗体与塑料孔之间的相互作用会产生吸收和固定。
这种被动结合受多种因素影响,包括塑料的表面化学性质、温度、包被缓冲液的 pH 值、抗原/抗体浓度和时间。
常用的包被缓冲液包括磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS)、碳酸氢钠或类似缓冲液,但应测试和优化这些条件。
重要的是,包被缓冲液不应含有会竞争地结合抗原或抗体的蛋白。
微孔板
可以用多种微孔板样式进行 ELISA,包括 96 孔微孔测试条、96-、384- 和 1536-孔板。
最常见的平板有平坦孔底,并且由聚苯乙烯制成。平板用多种方式处理,以产生疏水/亲水或特异性反应部分。
例如,使用蛋白 A 来更特异性地结合表面。选择优质平板和表面包被有利于降低背景,并增强结合。
检测化学成份通常会影响平板颜色选择:发色法为透明色,荧光法为黑色,比色法为白色。
ELISA 抗体
为 ELISA 选择的抗体应仔细选择,并验证使用。根据所选抗体能否高度特异性地结合目的抗原,可预测实验是否成功和结果是否可靠。除了特异性,选择的抗体还应对抗原具有较高的亲和力和亲合力。换言之,抗体应结合在一种物种的一个抗原上的表位(特异性),这种结合应快速而有力(亲和力),并且一旦结合,抗体-抗原复合体应稳定(亲合力)。
为夹心检测选择的抗体更复杂,因为每种抗体需要定向一个不同的表位。根据实验需要,夹心检测的 2 种抗体可以来源于不同物种或相同物种。
在 ELISA 中可使用单克隆抗体和多克隆抗体,但两者都能提供某些有利于实验者的优势。
在 ELISA 中使用单克隆抗体或多克隆抗体的优势
单克隆抗体:
多克隆抗体:
可检测同一抗原上不同表位的抗体并集
可能会检测一个靶蛋白上的多个结合位点,因此可提供更稳定的信号
对于需要用某种酶(如 HRP 或 AP)标记的抗体,标记效率、批间变化和偶联后的一致性结合都是设计一个高质量实验需要处理的问题。
ELISA 对照
对照对确保每份样品产生的信号在生理学上都是准确的非常重要。可以合并使用一组对照来验证一个 ELISA 实验的有效性。有如下对照:
●空白对照可用来提供背景信号参考,并确保读取值表示样品中的分析物浓度,而不是实验设置的人为结果。
●阳性和阴性对照可用来比较分析物产生的信号。
●加标对照可用来给出有关某种特殊样品基质中分析物发现程度的信息,从而表明检测性能。
微孔读板机
所选择的微孔读板机应匹配 ELISA 中使用的检测类型。比色反应的灵敏度最低,其次是化学发光和荧光反应。使用的检测类型应根据样品分析物数量以及是否需要放大和/或多重分析来决定。重要的是,用特定微孔读板机检测的动态范围和灵敏度应该还会影响检测方法的选择。
如何优化 ELISA 方法
优化一个 ELISA 实验对其成功必不可少。ELISA 是一个多步骤流程,因此在开始一个实验之前,单独检测每个组分。
样品制备
缓冲液(包被、封闭、裂解/结合、洗涤)
●被缓冲液应保留所有蛋白的生物活性和稳定性,尤其是结合的分析物,不得干扰其与塑料的被动结合,或改变他们的表位。
●封闭缓冲液应包含浓度适当的非离子去垢剂和/或非特异性蛋白,以结合包被平板上的开放位点。
●样品应放在裂解缓冲液(如果使用细胞)或配制的结合缓冲液中。
需谨慎操作,以便裂解缓冲液的组分不会干扰抗原/抗体结合,但仍能裂解细胞。
●洗涤缓冲液应含有适量的盐和去垢剂,并且 pH 值 应适当,以稳定抗体-抗原复合体,同时降低背景噪音。
微孔板
各孔之间的一致性对于确保一个 ELISA 的准确性和可重复性是必不可少的。这包括正确选择平板,准确移液,维持温度、湿度和 pH 值。对于平板包被,最佳的包被条件和平板-结合能力根据每种蛋白有所变化,并应根据实验决定。
抗体
ELISA 结果
ELISA 结果分为 3 大类:定量、半定量和定性。
定量 ELISA 需要使用标准品,以解释实验样品的结果。生成标准曲线(通常借助梯度稀释且浓度已知的某种分析物或其他标准品)。将样品的读取值与标准曲线进行比较,并确定绝对定量的分析物浓度。
如果认为某个 ELISA相对定量或半定量,则应互相比较实验样品的读取值,或与参照样品进行比较,并且分析物的浓度以这些其他样品的相对浓度表示。
与空白孔或无关对照相比,使用信号的存在来决定某种分析物是否只存在或不存在于样品中时,便是定性 ELISA。
如何解释 ELISA 结果
通常,每个 ELISA 孔的读取值为一个数值。ELISA 结果显示为与分析物浓度对数相对的相对光单位 (RLU) 或相对荧光单位 (RFU) 测量值。
为了测定每个孔中分析物的绝对浓度,需要使用对已知数量的抗原进行梯度稀释构建的标准曲线。接下来,将在每份实验样品中检测到的信号测量值与标准曲线进行比较,即可得到分析物的浓度。对于这类分析,需要会产生高敏实验的实验设计。
如果不需要绝对定量,则互相比较样品或与某种对照样品比较,以进行相对定量。例如,HIV 感染后产生的血清抗体样品可以与基础血清抗体样品进行比较,并且两个测量值的比值就指示 HIV 诱发抗体数量的倍数变化。
最后,如果不需要进行定量分析,则与某种空白样品或阴性对照相比存在任何信号就指示存在分析物。这是最不精确的分析类型。
在进行 ELISA 检测时最常见的问题