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什么是ELISA?
酶联免疫吸附试验 (Enzyme-linked Immunosorbent Assay,简称ELISA), 是一种利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定性和定量检测方法,是免疫学经典实验方法。ELISA可适用多种样本类型,主要包括血清、血浆、细胞培养物上清液、细胞裂解物、唾液、组织裂解物和尿液等。
ELISA检测原理是将针对目标分析物的特异性捕获抗体包被于微孔板底部,加入待测样本孵育后,再加入酶标记的检测抗体后形成捕获抗体-样本-检测抗体的‘三明治’夹心。最后加入酶反应的底物进行显色反应,显色产生信号值与所结合的分析物量成正比。ELISA 检测通常在96孔板中进行。
ELISA 方法和原理?
实验设置将根据所使用的具体 ELISA 类型有所不同(见下文有关各类 ELISA 的详细说明)。其中一种最简单的 ELISA 形式是从将目的抗原固定在一个固体表面开始。这通常用一块能够被动结合蛋白的 96 孔或 384 孔板完成。通过偶联某种酶来制备相应抗体。添加这种偶联物到样品中即可让抗体结合抗原。对目的抗原不具特异性的结合物质可以随后用洗涤步骤去除。随后添加酶的底物,以让溶液中的底物与连接抗体的酶发生反应,最终产生颜色、荧光或发光变化,读取这种变化即可测定每份样品中靶标的数量。
ELISA 的应用
ELISA 可用来定量一份检测样品中的一种或多种抗原。鉴于抗体试剂的特异性以及检测的简易性,ELISA 通常被视为生物样品定量检测的金标准。在生物医学/生物化学领域,使用抗体-抗原结合连同信号放大的 ELISA 原理的检测非常普遍。在研究实验室,这些检测可用来定量蛋白水平或通路激活。在临床上,ELISA 有各种用途,包括测定患者血清样品中药物治疗的生物标记物或细胞因子水平。ELISA 还适用于植物生物学,并且可用于检测农作物过敏原。
将 ELISA 用作一种研究工具在多种研究领域都会用到 ELISA 平台。它能特异并灵敏地检测抗体,因此是一种方便的生物发现工具。它在所有生物研究领域中被广泛用来检测和定量目的抗原。这类抗原会被分泌成细胞培养基、某种细胞中的总蛋白,或细胞信号转导期间发生的翻译后修饰 (PTM)。将 ELISA 用作一种诊断工具除了用于研究之外,ELISA 还广泛用于诊断检测,包括对病毒感染、食物过敏原、毒性和癌症的诊断检测。用抗体检测感染性病毒是一种快速的临床检测,这种检测在扩展后可同时检测多份样品。这些检测通常在血清或血样上完成,但也可以使用细胞或组织的裂解物进行。
ELISA的优势
ELISA 检测通常使用基础混合物、洗涤实验步骤和简单的设备,这使它们易于在实验室进行。关键试剂(抗体)会特异性结合其靶标,脱靶率很低,这可产生高敏感性和高特异性结果。此外,数据分析通常非常简单,数据可以是定量或定性数据,具体取决于实验设置,并且结果明确,易于解释。实验室 ELISA 检测所需设备通常可以在多数研究和临床实验室中找到(能够测定吸光度、荧光和/或化学发光的读板机)。对于其他应用,读取的可以是彩色的点或线。ELISA 检测还可以扩展,并且可以借助实验室的 96 孔或 384 孔板、非处方孕检等各种形式。ELISA 检测的另外一个优势是经 ELISA 验证的抗体可以大规模重复,从而可为长期使用提供稳定的试剂来源
ELISA基本类型
ELISA可用于测定抗原,也可用于测定抗体。这种测定方法中有3种必要的试剂:
1. 固相的抗原或抗体;
2. 酶标记的抗原或抗体;
3. 酶作用的底物。
根据试剂的来源和标本的性状及检测的具备条件,可设计出各种不同类型的检测方法。
1. 双抗体夹心法测抗原
夹心法ELISA是最常见的ELISA类型。两种特异性抗体将抗原夹在中间,通常称为配对的抗体对。将捕获抗体包被在微孔板上,加入样品后,捕获抗体与样本结合,然后再加入酶标记的检测抗体,形成夹心抗体对。最后加入酶反应的底物进行显色反应,显色产生信号值与所结合的分析物量成正比。夹心法ELISA使用两种抗体与抗原结合,因而更具特异性。
夹心法ELISA适用于确定生物样本中的分析物浓度。
优点:
• 最高的特异性和灵敏性
• 与复杂的样品基质兼容
缺点:
• 实验流程较长
• 开发具有挑战性
2. 竞争法测
目的蛋白太小而不能用两种抗体有效地夹住时可采用竞争性法ELISA。该法也是将捕获抗体包被在微孔板上。与夹心法ELISA不同的是,该法不使用标记的检测抗体,而是使用标记的抗原。该抗原可与样本中的目标抗原竞争性结合捕获抗体。样品中存在的抗原越多,能够与捕获抗体结合的标记抗原就越少。加入底物并产生信号,信号值与样品中存在的蛋白量成反比。
竞争法ELISA适用于确定小分子和激素的浓度。
优点:
• 能够定量小分子
缺点:
• 仅使用一种抗体,因此特异性不够高
• 需要标记抗原
3. 直接法测抗原
直接法ELISA是将抗原固定于微孔板上,使用酶标抗体孵育抗原, 最后加入酶反应的底物进行显色反应,显色产生信号值与所结合的分析物量成正比。因直接法ELISA仅使用一种抗体,它的检测特异性不高,低于夹心法ELISA。直接法ELISA适用于评估抗体的亲和力和特异性及研究阻断/抑制相互作用。
4. 间接法测抗体
间接法ELISA与直接法ELISA相似,也是将抗原直接固定在微孔板上。但它步骤中包括额外的信号放大检测。首先,将不带标记的检测一抗加入微孔板,与板内抗原特异结合。接着加入酶标二抗识别一抗。最后加入酶反应的底物进行显色反应,显色产生信号值与所结合的分析物量成正比。
间接法ELISA适用于测定内源性抗体。
优点:
• 利用二抗进行信号放大
缺点:
• 二抗可能引起交叉反应
多重 ELISA
多重 ELISA 可让研究人员一次性评估多个蛋白靶标的水平,它通常用于同时测定多个细胞因子的表达。与传统 ELISA 形式不同,多重 ELISA 方法采用以下一种或多种技术:流式细胞术、荧光、化学发光或电化学发光法。流式细胞分析是最常用的多重 ELISA 方法,并使用珠子偶联抗体进行。通常,与其他方法相比,使用流式细胞术和珠子偶联抗体可以一次性测定更多细胞因子。
ELISA实验基本流程
样品采集和存储
以下为样品采集和储存条件的通用原则:
血浆 – 采集血浆时可使用EDTA、肝素或柠檬酸盐作为抗凝血剂。采集后30分钟内, 1000 × g离心15分钟。立即检测或分装后于≤-20°C储存。避免反复冻融。细胞培养上清液 – 通过离心去除颗粒,立即检测或分装后将样品于≤ -20°C储存。避免反复冻融。
细胞裂解液 – 在裂解缓冲液中裂解细胞并将其放在冰上静置30分钟。14,000 × g离心5分钟除去不溶物。将上清液转移至新管中利用总蛋白分析法定量总蛋白浓度。立即检测或分装后将样品于≤ -20°C储存。乏血小板血浆 – 在采集血浆时可使用EDTA、肝素或柠檬酸盐作为抗凝血剂。采集后30分钟内,1000 × g离心15分钟。建议在2-8°C下,10,000 x g 再次离心10分钟,以便完全去除血小板。立即检测或分装后于≤ -20°C储存。避免反复冻融。
血清 – 使用血清分离管(SST),让样品在室温下凝结30分钟,然后1000 × g离心15分钟。立即取出血清并进行检测或分装后于≤-20°C储存。避免反复冻融。
唾液 – 将唾液收集到管中,10,000 x g离心5分钟。收集水相,立即检测或分装后将样品于≤ -20°C储存。避免反复冻融。
尿液 – 无菌进行当天首次尿液的采集(中段尿),直接排入无菌容器中。离心去除不溶颗粒物质。立即检测或分装后于≤ -20°C储存。避免反复冻融。母乳 – 2-8°C,1000 x g 离心15分钟。重复进行水相部分的收集,总共3次。立即检测。
组织匀浆液 – 制备方法因组织类型而异。用1X PBS缓冲液冲洗以除去多余血液,使用20mL 1X PBS进行匀浆,并于≤ -20℃下储存过夜。将匀浆液冻融两次以便破坏细胞膜,然后5000 × g离心5分钟。去除上清液后立即进行检测,或者分装后于≤ -20°C储存。避免反复冻融。 组织裂解液 – 用PBS冲洗组织,将组织切成1-2毫米的薄片,用组织匀浆器在PBS中进行匀浆。加入等体积的含蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液,在室温下裂解组织30分钟,裂解过程中轻摇裂解液。离心去除沉淀。利用总蛋白质分析法定量总蛋白的浓度。立即检测或分装后于≤ -20°C储存。
数据分析:结果计算
以下为样品采集和储存条件的通用原则:
未知样品值根据标准曲线确定。如果样品经过稀释,则从标准曲线读取的浓度值须乘以稀释倍数。ELISA 实验建议至少进行2-3次重复。这样可提供足够的数据用于结果的统计验证。将每个标准品和样品的校正吸光度值、复孔读数取平均值,然后减去平均零标准品OD值。
复孔检测结果的变异系数(CV)应当≤ 20%。建立标准曲线 – 使用能够绘制平均吸光度(y轴)对蛋白质浓度(x轴)曲线的计算机软件来简化数据。如有可能,使用操作手册中推荐的数据简化方法。如果推荐的数据简化方法不可行,建议尝试其他方法(如线性、半对数、对数/对数、4或5个参数模型)确认何种曲线与数据的拟合度最好。
确定曲线拟合是否正确的一种方法是进行标准曲线OD值的反向拟合。首先绘制标准曲线将标准品视为未知,在标准曲线中插入OD值对应的浓度读数应接近预期值(+/- 10%)。
如果无可用软件,可尝试在线性范围内将浓度的对数值与OD值的对数值作图,将数据线性化。最佳拟合线可通过回归分析确定。此过程将产生足够但不太精确的数据拟合。下图展示了一条有代表性的标准曲线,数据来自R&D人IL-6 HS Quantikine ELISA(货号 HS600C)。
计算样品中目标蛋白浓度
可通过标准曲线确定每个样品的浓度,首先在y轴上找到吸光度值,水平延伸至标准曲线,在交点处作垂线延伸至x轴并读取相应的浓度。若样品经过稀释,则从标准曲线中读取的浓度须乘以稀释倍数。
计算变异系数
变异系数(CV)是标准偏差与平均值的比值,通常以百分比表示。