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药物研究ADME包括吸收、分配、代谢、排泄和毒性等多个方面,而吸收是第一步。在细胞模型上进行内皮细胞通透性、药物渗透等实验中,默克生命科学Millipore的Millicell ® 细胞电阻仪和细胞培养板是常用的产品组合。
Millicell® ERS-2 电阻仪
Millicell ® ERS-2电阻仪是测定培养的上皮细胞的电阻或跨上皮细胞电阻(TEER) 的可靠设备。采用交流电(AC)定量检测单层的健康状态和细胞融合度。两个电极尖端的Ag/AgCl用来测量电压。由于电极设计得非常小,实验者可以非常方便地测量微孔膜上生长的上皮细胞的膜电压及电阻。交流电设计与传统直流电装置相比也具有一些优势:膜电压和电极偏移不会影响电阻的精确测定;细胞上的零静电荷消除了DC电流对细胞膜产生的不利影响;没有金属电极的电化学沉积问题。
系统参数
组成:测量仪表,STX01电极,STX04校正系统用电极,充电器
膜电压范围:± 900.0 mV
电压测量:0.1 mV
电阻范围:0 ~10000 Ω
电阻分辨率:1 Ω
交流方波电流:± 10 μA nominal at 12.5 Hz
电源:内置 6 V NiMH 2,200 mAH电池,外接12 VDC电源供充电
每充电12h电池可用时间:8–10 h
模拟输出:1–10 V (1 mV/ohm)
环境要求:50–100 °F (10–38 °C)
0–90% non-condensing relative humidity
尺寸:19 × 11 × 6 cm
重量:1.4 kg
|
货号 |
Millicell ® ERS-2 Voltohmmeter |
MERS00002 |
Replacement Electrodes |
MERSSTX01 |
Replacement Test Electrodes |
MERSSTX04 |
Specialized Electrodes (for Millicell® -96 well plate only) |
MERSSTX00 |
Replacement Battery 6V NiMH 2200mAH |
MERSBAT01 |
Millicell ERS-2 包含组分
(如下附件同时与Millicell ERS型号匹配 MERS00001)
· 固定电极对
宽4mm , 厚1mm
· 每个探针都包含内外电极
内:银芯片
外:银/氯芯片
· 电极长度不等,保证电极放在合适的位置进行测量
可调节电极(MERSSTX03)
• 测量仪可选产品
• 类似于固定电极,不过当滤膜底部和板底部的间距更大时会更精准一些(例 如Millipore的millicell小室)
校验电极(MERSSTX04)
• 用于常规校验测量仪的模拟检测电极
专用高通量电极(MERSSTX00)
•测量仪可选产品
•专门用于测量 millicell 96孔板细胞培养小室
Millicell® ERS-2 使用说明书
系统测试
在进行测量前,需要先进行下列系统功能测试
(注意:首次使用电阻仪时要充电至少24小时)
仪表功能检测
1. 将仪表与充电器断开;
2. 将STX04测试电极(具有较短电线的电极)与仪表连接:将电极末端的插头插入仪表上的INPUT接口;
3. 开关打到ON,选择模式Ohms (Ω);
4.此时仪表读数应显示为1000Ω,如果不是,用3/32”扁平头螺丝刀调节R Adj旋钮,直到读数显示为1000Ω。
平衡电极(仅测量电压时需要)
用Millicell ERS-2系统进行电阻测量时,可以直接使用电极而不需要平衡。当进行电压测量时,STX01电极需要进行平衡。
平衡时,准备与测量溶液相似的电极溶液,或者使用PBS缓冲液,0.15MNaCl或0.1M KCl溶液。
1.将Millicell ERS-2 仪表与充电器断开;
2. 将STX01电极与仪表连接:将电极末端插头插入仪表上的INPUT接口;
3. 开关打到OFF,模式打到Ohms (Ω),将电极浸入电极缓冲液;下表列出了推荐的平衡时间;
4. 进行电极功能检测。
电极状态 | 浸入溶液时间 |
从未被测试 | 24h |
干燥储存 | 24h |
在溶液中储存 | 2h |
1. 将仪表与充电器断开,模式调到Millivolts;
2. 将电极头部浸入与培养基相似的电极液中(或者0.1-0.15M NaCl/KCl溶液);
3. 打开开关到ON;
4. 如果仪表显示为0,表示电极可以进行电压测量了。
测量细胞电阻和电压
一、物品准备(在超净台中准备如下物品)
1. 完全充好电的Millicell ERS-2系统
2. STX04测试电极
3. STX01或者STX03电极 (用于检测Millicell 6, 12和24孔板), STX00电极(用于检测Millicell 96孔板),如果要测量电压则要先进行电极平衡
4. 未培养细胞的Millicell培养皿(对照)
5. 培养了细胞的Millicell培养皿
6. 70%的乙醇
7. 3/32”平头螺丝刀
二. 电极灭菌
电极是非无菌的,我们建议使用乙醇灭菌,也可以用环氧乙烷、紫外线或者杀菌剂灭菌。不能使用高温或者火焰灭菌,因为电极无法承受高温。乙醇灭菌流程如下:
1. 将电极插入70%乙醇浸泡15min进行灭菌,取出电极风干15秒;
注意:不能将电极浸入乙醇中超过30min,这会损坏电极的保护层,缩短其使用寿命。
2. 用与培养基相似的电极液(或者0.1-0.15M NaCl/KCl)冲洗电极;
3. 若是进行电阻测量,此时电极已可以使用;
4. 若是进行电压测量,将电极在与培养基相似的无菌电极缓冲液中平衡15分钟。注意:为了保持无菌,可以将电极放在紫外灯下短时间照射。
三. 电阻测量(量程:0-9999Ω,灵敏度:1Ω)
注意:虽然仪表量程能够达到13,000Ω,但是10,000Ω及以下的读数才具准确性。
1. 将细胞置于室温下平衡30分钟;
2. 如前所述,测试Millicell ERS-2系统;
3. 确保仪表与充电器断开;
4. 将模式打到Ohms,开关打到ON;
5. 将电极短端浸入培养板内部,长端浸入外部。短端不要碰到小室膜上生长的细胞,长端需碰到外侧孔的底部。为了实验结果的稳定和可重复性,确保电极平稳,并与培养板成90°;
6. 记录电阻值。
四. 空白电阻测量
1. 在培养孔中插入没有培养细胞的小室,加入培养基;
2. 按照电阻测量步骤5中的方法测量空白杯中的电阻值。
五. 电阻计算
1. 组织电阻
• 用含细胞的培养板测出的电阻减去空白电阻,就是真正的组织电阻
2. 单位面积电阻
• 电阻与组织面积成反比。膜越大,电阻越低。
注意:24mm或更大直径培养板的电阻值不应该换算成单位面积电阻,因为STX电极不能在一个相对大的膜面积内产生均一的电流密度。
• 单位面积电阻与膜面积无关,12mm及以下培养板上获得的数据可以用来比较。
• 单位面积电阻用真实组织电阻乘以有效表面积即可,单位是Ωcm 2 。有效膜面积在下表中列出。
• 单位面积电阻=电阻(Ω)×有效膜面积(cm 2 )
•单位面积=1cm 2
Millicell 插入式细胞培养皿与培养板有效膜面积
产品类型 |
直径( mm ) |
膜面积 ( ㎝²) |
6-well站立式培养皿 |
30 |
4.2 |
24-well站立式培养皿 |
12 |
0.6 |
6-well悬挂式培养皿 |
24 |
4.5 |
12-well悬挂式培养皿 |
12 |
1.1 |
24-well悬挂式培养皿 |
6.5 |
0.3 |
24-well培养板 |
10 |
0.7 |
96-well培养板 |
4 |
0.11 |
1. 将细胞置于室温下平衡30分钟;
2. 如前所述,测试Millicell ERS-2系统,并确保电极经过平衡;
3. 将模式调到Millivolts,开关打到ON;
4. 将电极短端浸入培养皿内部,长端浸入外部。短端不要碰到膜上生长的细胞,长端需碰到外侧的底部。为了实验结果的稳定和可重复性,确保电极平稳,并与培养板成90°;
5. 记录电压值。
注意:在几次测量之间,为了避免样品交叉需要冲洗电极,请用培养液冲洗,而不是蒸馏水。
系统的维护与保存
一. 仪表
不用的时候,仪表应该与充电器保持连接,电池会处于持续充电状态,可以随时使用。仪表大约可使用8小时,当电量很弱时会自动关机以避免对仪器造成损害。
注意:为了避免腐蚀,不要将生理盐水或者培养液溅到或泼到仪表上。
二. 电池更换
1. Millicell ERS-2配备了一个6V 220 mAh可充电NiMH电池,可重复充电约500次。电池可在任何放电状态充电,可持续充电而不造成损害。
注意:为了避免对电池造成损害,请只使用配备的充电器充电。
2. 根据使用情况,电池寿命约为1到2年,NiMH电池不使用时也是持续放电的。为了防止电池自放电,至少每两个月给电池充一次电。
三. 电极保存
1. 短时间存放(少于两周):用于电阻测量,干燥存放即可。用于电压测量存放,将电极浸入电极液中。将电极电缆插头与仪表连接,系统内部就短路了,电极的平衡得以维持。
2. 长时间存放(多于两周):用Milli-Q水冲洗去除盐及蛋白质,并在干燥避光处保存。
四. 电极清洗
1. 用浸有70%乙醇的棉签轻轻擦拭电极头部;
2. 如需进一步清洗,将电极头部放在未稀释的家用漂白剂里3分钟。不要让漂白剂接触到头部以上部位。然后立刻用水冲洗;
3. 砂纸打磨(仅当电压测量时):用提供的深蓝色砂纸轻轻擦拭电压电极(位于电极头部附近表面内部的两个银色芯片),不要擦拭头部外侧的银色芯片。
问题解决
如果担心实验出现问题,首先可以按照如下方法排查Meter和电极的状态。
1)Meter坏掉通常是由于仪表上的按钮接触到培养基或者盐离子被腐蚀。如果功能性检测没有问题,说明Meter是正常的。
2)电极如果坏了,最常见的现象是读数不稳定,或者读数异常高。建议使用如下方法检测电极是否有问题。在孔板中加入PBS等缓冲液(不加入小室),电阻值<50Ω,孔板中加入PBS缓冲液和空白小室,电阻值在80Ω ~ 200Ω(与小室的品牌和大小有关)。如果读数不在这个范围内,建议更换电极。上述正常则表明硬件没有问题。对于实验设计的问题,老师可以参考相应细胞系的文章。
1. 固定电极和可变电极的区别
MERS00002中包含固定电极,但不包含可变电极。固定电极(MERSSTX01)的两个电极的高度差是固定的。对于可变电极,可以通过调节长电极的高度调节两个电极之间的高度差。固定电极适用于除96孔板以外的所有Millicell小室。使用Millipore的millicell,小室底面与孔板底面距离更大,建议购买可变电极,货号MERSSTX03。
2. 测量细胞电压和电阻时,屏幕显示的数值左右摆动,不稳定
确保电阻仪与电源断开;电量不能过低;细胞平衡到室温(半个小时以上,温度会影响电阻值);检查电极的放置方法是否正确(确保电极浸入液面以下,在测量过程中保证电极位置不动);如果是测量电压,需要在测量前平衡电极;清洗电极;确保电极与仪表不要靠太近,以免产生电磁场,影响测量。
3. 电阻值低于预期值
进行仪表功能检测;检查培养基是否污染;有可能细胞没有形成致密单层,需要继续培养。
4. 测量细胞电阻时,电阻值高于正常值
清洗电极,确保电阻仪与电源断开;电量不能过低;细胞平衡到室温(半个小时以上,温度会影响电阻值);检查电极的放置方法是否正确。
5. 如何更换电池
使用螺丝刀取下电阻仪背面四个角的螺丝。打开后盖,电池通过两颗螺丝固定在后盖上。拔下电线上的白色接头即可更换电池。通过螺丝刀将后盖固定在电阻仪上。换好电池后,电阻仪需要充电至少24h。